Виявлення Erysipelothrix rhusiopathiae методом ПЛР у реальному часі із використанням EvaGreen

Анотація

Метою даного дослідження було розроблення та оцінка методу ПЛР у реальному часі з використанням EvaGreen для швидкого, чутливого та специфічного виявлення Erysipelothrix rhusiopathiae, збудника бешихи свиней та важливого зоонозного патогену.
Для ампліфікації на платформі ПЛР у реальному часі iTower (Jena Analytik, Німеччина) використовували видоспецифічні праймери, спрямовані на ген spaA E. rhusiopathiae. Умови реакції були оптимізовані з використанням флуоресцентного барвника EvaGreen. Аналітичну чутливість визначали за допомогою десятикратних послідовних розведень очищеної геномної ДНК, тоді як специфічність оцінювали щодо нецільових видів бактерій, які зазвичай зумовлюють інфекції у свиней. Клінічні зразки, отримані від свиней з підозрою на бешиху, включаючи мигдалики, селезінку, лімфатичні вузли, серцеві клапани, кров та синовіальну рідину, були протестовані для оцінки діагностичної застосовності.
Розроблений тест успішно виявив ДНК E. rhusiopathiae у всіх позитивних контролях та польових позитивних зразках. Межа виявлення була встановлена на рівні 10 фг/мкл. Аналіз стандартної кривої продемонстрував чудову лінійність (R² = 0,998) та високу ефективність ампліфікації (98,4%). Ампліфікації не спостерігалося з ДНК нецільових бактерій, що підтвердило високу аналітичну специфічність. Усі позитивні зразки дали один характерний пік плавлення при 81,7 ± 0,3 °C, що вказує на специфічну ампліфікацію. Серед 48 польових зразків 19 (39,6 %) дали позитивний результат, причому найвищі показники виявлення спостерігалися у тканинах мигдаликів та селезінки. Внутрішньо- та міжтестова варіація залишалася нижче 3 %, що підтверджує високу повторюваність та відтворюваність.
Аналіз EvaGreen у режимі реального часу є швидким, надійним та економічно ефективним молекулярним методом виявлення E. rhusiopathiae. Його висока чутливість, специфічність та надійність роблять його придатним для рутинної ветеринарної діагностики, розслідування спалахів та епідеміологічного нагляду за еризепелою свиней. Цей аналіз може слугувати ефективною альтернативою системам ПЛР у режимі реального часу на основі зондів, особливо в лабораторіях з обмеженими ресурсами.