PCR-Based Detection of Priority Bacterial Biological Threat Agents: Advances in Diagnosis of Anthrax, Tularemia and Brucellosis

А. П. Герілович; Н. О. Шевченко; Г. Є. Ананьїна; Е. О. Нардід; Л. В. Степанюк; А. М. Сергієнко; В. П. Марценюк

doi:10.31073/onehealthjournal2026-IV-01

Автор(и)

А. П. Герілович Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної академії наук України, Харків, Україна https://orcid.org/0000-0002-3280-4172
Н. О. Шевченко Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної академії наук України, Харків, Україна https://orcid.org/0000-0001-6794-1444
Г. Є. Ананьїна Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної академії наук України, Харків, Україна https://orcid.org/0000-0003-2065-3159
Е. О. Нардід Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної академії наук України, Харків, Україна https://orcid.org/0000-0002-1047-6665
Л. В. Степанюк Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної академії наук України, Харків, Україна https://orcid.org/0000-0001-6491-8791
А. М. Сергієнко Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної академії наук України, Харків, Україна https://orcid.org/0009-0004-0272-1773
В. П. Марценюк Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної академії наук України, Харків, Україна https://orcid.org/0000-0002-3051-952X

DOI:

https://doi.org/10.31073/onehealthjournal2026-IV-01

Ключові слова:

Єдине здоров’я, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), ПЛР у режимі реального часу (qPCR), мультиплексна ПЛР, цифрова ПЛР (dPCR), Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Brucella spp., біологічний нагляд, біозахист, молекулярна діагностика, біологічні агенти загрози

Анотація

Швидке та точне виявлення бактеріальних патогенів високої небезпеки є критично важливим для забезпечення готовності систем громадського здоров’я, ветеринарної медицини, безпечності харчових продуктів та біозахисту. У межах концепції «Єдине здоров’я» (One Health) молекулярна діагностика стала невід’ємним інструментом інтегрованого епідеміологічного нагляду за зоонозними захворюваннями, що становлять загрозу для здоров’я людей, тварин і довкілля. У цьому огляді узагальнено сучасні досягнення щодо застосування методів полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для виявлення трьох пріоритетних бактеріальних біологічних агентів загрози: Bacillus anthracis, Francisella tularensis та Brucella spp. Розглянуто принципи молекулярної діагностики, основні генетичні мішені, вибір клінічного матеріалу та діагностичні характеристики класичної ПЛР, ПЛР у режимі реального часу (qPCR), мультиплексної ПЛР, вкладеної (nested) ПЛР, цифрової ПЛР (dPCR) та ізотермічної петльової ампліфікації (LAMP). Особливу увагу приділено ролі мультиплексних молекулярних тестів для одночасного виявлення та диференціації біологічних агентів загрози, що забезпечує підвищення швидкості, чутливості та безпечності лабораторної діагностики. Також висвітлено розширення сфер застосування ПЛР-технологій у біологічному нагляді, моніторингу довкілля, дослідженні диких тварин і переносників, розслідуванні спалахів захворювань та забезпеченні лабораторної готовності до надзвичайних біологічних ситуацій. Проаналізовано перспективні напрями розвитку, зокрема портативні платформи ПЛР для діагностики за місцем надання допомоги (point-of-care), CRISPR-асоційовані методи молекулярної діагностики, інтеграцію з повногеномним секвенуванням, використання штучного інтелекту для аналізу даних та хмарних систем епідеміологічного нагляду як складових сучасних стратегій біозахисту. У сукупності ці технології сприяють зміцненню інтегрованого нагляду в рамках концепції «Єдине здоров’я», забезпечуючи швидке виявлення патогенів, удосконалення епідеміологічних досліджень і своєчасне реагування як на природні спалахи інфекційних хвороб, так і на навмисне застосування біологічних агентів, що підсилює глобальну безпеку здоров’я та сучасну систему лабораторної готовності.

Посилання

Baily G. G., Krahn J. B., Drasar B. S., Stoker N. G. (1992). Detection of Brucella melitensis and Brucella abortus by DNA amplification. Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 95(4), 271–275.

Bricker B. J., Halling S. M. (1994). Differentiation of Brucella abortus bv. 1, 2, and 4, Brucella melitensis, Brucella ovis, and Brucella suis bv. 1 by PCR. Journal of Clinical Microbiology, 32(11), 2660–2666. https://doi.org/10.1128/JCM.32.11.2660-2666.1994

Burkardt H.-J. (2000). Standardization and quality control of PCR analyses. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 38(2), 87–91. https://doi.org/10.1515/CCLM.2000.014

Bustin S. A., Benes V., Garson J. A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M. W., Shipley G. L., Vandesompele J., Wittwer C. T. (2009). The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry, 55(4), 611–622. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797

Carlson C. J., Albery G. F., Merow C., Trisos C. H., Zipfel C. M., Eskew E. A., Olival K. J., Ross N., Bansal S. (2022). Climate change increases cross-species viral transmission risk. Nature, 607(7919), 555–562. https://doi.org/10.1038/s41586-022-04788-w

Centers for Disease Control and Prevention. (2023). Laboratory Response Network. https://www.cdc.gov/lrn

Chen J. S., Ma E., Harrington L. B., Da Costa M., Tian X., Palefsky J. M., Doudna J. A. (2018). CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science, 360(6387), 436–439. https://doi.org/10.1126/science.aar6245

Chiu C. Y., Miller S. A. (2019). Clinical metagenomics. Nature Reviews Genetics, 20(6), 341–355. https://doi.org/10.1038/s41576-019-0113-7

Dennis D. T., Inglesby T. V., Henderson D. A., Bartlett J. G., Ascher M. S., Eitzen E., Fine A. D., Friedlander A. M., Hauer J., Layton M., Lillibridge S. R., McDade J. E., Osterholm M. T., O'Toole T., Parker G., Perl T. M., Russell P. K., Tonat K. (2001). Tularemia as a biological weapon: Medical and public health management. JAMA, 285(21), 2763–2773. https://doi.org/10.1001/jama.285.21.2763

Destoumieux-Garzón D., Mavingui P., Boetsch G., Boissier J., Darriet F., Duboz P., Fritsch C., Giraudoux P., Le Roux F., Morand S., Paillard C., Pontier D., Sueur C., Voituron Y. (2018). The One Health concept: 10 years old and a long road ahead. Frontiers in Veterinary Science, 5, 14. https://doi.org/10.3389/fvets.2018.00014

Drain P. K., Hyle E. P., Noubary F. (2014). Diagnostic point-of-care tests in resource-limited settings. The Lancet Infectious Diseases, 14(3), 239–249. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(13)70250-0

Easterday W. R., Van Ert M. N., Simonson T. S., Wagner D. M., Kenefic L. J., Allender C. J., Keim P. (2005). Use of single nucleotide polymorphisms in the plcR gene for specific identification of Bacillus anthracis. Journal of Clinical Microbiology, 43(4), 1995–1997. https://doi.org/10.1128/JCM.43.4.1995-1997.2005

Ellis J., Oyston P. C. F., Green M., Titball R. W. (2002). Tularemia. Clinical Microbiology Reviews, 15(4), 631–646. https://doi.org/10.1128/CMR.15.4.631-646.2002

Elnifro E. M., Ashshi A. M., Cooper R. J., Klapper P. E. (2000). Multiplex PCR: Optimization and application in diagnostic virology. Clinical Microbiology Reviews, 13(4), 559–570. https://doi.org/10.1128/CMR.13.4.559-570.2000

García-Yoldi D., Marín C. M., de Miguel M. J., Muñoz P. M., Vizmanos J. L., López-Goñi I. (2006). Multiplex PCR assay for the identification and differentiation of all Brucella species and the vaccine strains Brucella abortus S19 and RB51 and Brucella melitensis Rev1. Clinical Chemistry, 52(4), 779–781. https://doi.org/10.1373/clinchem.2005.062596

Godfroid J., Scholz H. C., Barbier T., Nicolas C., Wattiau P., Fretin D., Whatmore A. M., Cloeckaert A., Blasco J. M., Moriyón I., Saegerman C., Muma J. B., Al Dahouk S., Neubauer H., Letesson J.-J. (2011). Brucellosis at the animal/ecosystem/human interface at the beginning of the 21st century. Preventive Veterinary Medicine, 102(2), 118–131. https://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2011.04.007

Gootenberg J. S., Abudayyeh O. O., Lee J. W., Essletzbichler P., Dy A. J., Joung J., Verdine V., Donghia N., Daringer N. M., Freije C. A., Myhrvold C., Bhattacharyya R. P., Livny J., Regev A., Koonin E. V., Hung D. T., Sabeti P. C., Collins J. J., Zhang F. (2017). Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 356(6336), 438–442. https://doi.org/10.1126/science.aam9321

Gwinn M., MacCannell D., Armstrong G. L. (2019). Next-generation sequencing of infectious pathogens. JAMA, 321(9), 893–894. https://doi.org/10.1001/jama.2018.21669

Hindson B. J., Ness K. D., Masquelier D. A., Belgrader P., Heredia N. J., Makarewicz A. J., Bright I. J., Lucero M. Y., Hiddessen A. L., Legler T. C., Kitano T. K., Hodel M. R., Petersen J. F., Wyatt P. W., Steenblock E. R., Shah P. H., Bousse L. J., Troup C. B., Mellen J. C., Colston B. W. (2011). High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry, 83(22), 8604–8610. https://doi.org/10.1021/ac202028g

Hoffmaster A. R., Meyer R. F., Bowen M. D., Marston C. K., Weyant R. S., Thurman K., Messenger S. L., Minor E. E., Winchell J. M., Popovic T. (2002). Evaluation and validation of a real-time PCR assay for rapid identification of Bacillus anthracis. Emerging Infectious Diseases, 8(10), 1178–1182. https://doi.org/10.3201/eid0810.020393

Huggett J. F., Cowen S., Foy C. A. (2015). Considerations for digital PCR as an accurate molecular diagnostic tool. Clinical Chemistry, 61(1), 79–88. https://doi.org/10.1373/clinchem.2014.221366

Inglesby T. V., O'Toole T., Henderson D. A., Bartlett J. G., Ascher M. S., Eitzen E., Friedlander A. M., Gerberding J. L., Hughes J., McDade J. E., Osterholm M. T., Parker G., Perl T. M., Russell P. K., Tonat K. (2002). Anthrax as a biological weapon, 2002: Updated recommendations for management. JAMA, 287(17), 2236–2252. https://doi.org/10.1001/jama.287.17.2236

Janse I., Hamidjaja R. A., Bok J. M., van Rotterdam B. J., van der Plas J. (2010). Development and comparison of multiplex real-time PCR assays for the detection of bacterial biothreat agents. Applied and Environmental Microbiology, 76(18), 6104–6112.

Jones K. E., Patel N. G., Levy M. A., Storeygard A., Balk D., Gittleman J. L., Daszak P. (2008). Global trends in emerging infectious diseases. Nature, 451(7181), 990–993. https://doi.org/10.1038/nature06536

Keim P. S., Johansson A., Wagner D. M. (2007). Molecular epidemiology, evolution, and ecology of Francisella. Annals of the New York Academy of Sciences, 1105, 30–66. https://doi.org/10.1196/annals.1409.011

Keim P. S., Van Ert M. N., Pearson T., Vogler A. J., Huynh L. Y., Wagner D. M. (2006). Anthrax molecular epidemiology and forensics. International Journal of Food Microbiology, 112(1), 4–11.

Kilpatrick A. M., Randolph S. E. (2012). Drivers, dynamics, and control of emerging vector-borne zoonotic diseases. The Lancet, 380(9857), 1946–1955. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(12)61151-9

Kubista M., Andrade J. M., Bengtsson M., Forootan A., Jonák J., Lind K., Sindelka R., Sjöback R., Sjögreen B., Strömbom L., Ståhlberg A., Zoric N. (2006). The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine, 27(2–3), 95–125. https://doi.org/10.1016/j.mam.2005.12.007

Mackay I. M., Arden K. E., Nitsche A. (2002). Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research, 30(6), 1292–1305. https://doi.org/10.1093/nar/30.6.1292

Mock M., Fouet A. (2001). Anthrax. Annual Review of Microbiology, 55, 647–671. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.55.1.647

Moreno E. (2014). Retrospective and prospective perspectives on zoonotic brucellosis. Frontiers in Microbiology, 5, 213. https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00213

Morse S. S., Mazet J. A. K., Woolhouse M., Parrish C. R., Carroll D., Karesh W. B., Zambrana-Torrelio C., Lipkin W. I., Daszak P. (2012). Prediction and prevention of the next pandemic zoonosis. The Lancet, 380(9857), 1956–1965. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(12)61684-5

Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., Hase T. (2000). Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research, 28(12), e63. https://doi.org/10.1093/nar/28.12.e63

Olsen S. C., Palmer M. V. (2014). Advancement of knowledge of Brucella over the past 50 years. Veterinary Pathology, 51(6), 1076–1089. https://doi.org/10.1177/0300985814540545

Pappas G., Akritidis N., Bosilkovski M., Tsianos E. (2005). Brucellosis. New England Journal of Medicine, 352(22), 2325–2336. https://doi.org/10.1056/NEJMra050570

Probert W. S., Schrader K. N., Khuong N. Y., Bystrom S. L., Graves M. H. (2004). Real-time multiplex PCR assay for detection of Brucella spp., Brucella abortus, and Brucella melitensis. Journal of Clinical Microbiology, 42(3), 1290–1293. https://doi.org/10.1128/JCM.42.3.1290-1293.2004

Quick J., Ashton P., Calus S., Chatt C., Gossain S., Hawker J., Nair S., Neal K., Nye K., Peters T., de Pinna E., Robinson E., Struthers K., Webber M., Wilcox M., Loman N. J. (2016). Rapid draft and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella. Genome Biology, 16, 114. https://doi.org/10.1186/s13059-015-0677-2

Sjöstedt A. (2007). Tularemia: History, epidemiology, pathogen physiology, and clinical manifestations. Annals of the New York Academy of Sciences, 1105, 1–29. https://doi.org/10.1196/annals.1409.009

Taylor L. H., Latham S. M., Woolhouse M. E. J. (2001). Risk factors for human disease emergence. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 356(1411), 983–989. https://doi.org/10.1098/rstb.2001.0888

Turnbull P. C. B. (2008). Anthrax in Humans and Animals (4th ed.). World Health Organization.

Ip MCheuk E.S.C., Tsui M.H.Y., Kong F., Leung T.N., Gilbert G.L. (2006). Identification of a Streptococcus agalactiae Serotype III Subtype 4 Clone in Association with Adult Invasive Disease in Hong Kong. J Clin Microbiol44:.https://doi.org/10.1128/jcm.01533-06

Versage J. L., Severin D. D., Chu M. C., Petersen J. M. (2003). Development of a multitarget real-time TaqMan PCR assay for enhanced detection of Francisella tularensis in complex specimens. Journal of Clinical Microbiology, 41(12), 5492–5499. https://doi.org/10.1128/JCM.41.12.5492-5499.2003

Vogler A. J., Birdsell D., Price L. B., Bowers J. R., Beckstrom-Sternberg S. M., Auerbach R. K., Beckstrom-Sternberg J. S., Johansson A., Clare A., Buchhagen J. L., Petersen J. M., Pearson T., Vaissaire J., Dempsey M. P., Foxall P., Engelthaler D. M., Wagner D. M., Keim P. (2009). Phylogeography of Francisella tularensis: global expansion of a highly fit clone. Journal of bacteriology, 191(8), 2474–2484. https://doi.org/10.1128/JB.01786-08

Whatmore A. M., Koylass M. S., Muchowski J., Edwards-Smallbone J., Gopaul K. K., Perrett L. L. (2016). Extended multilocus sequence analysis to describe the global population structure of the genus Brucella: Phylogeography and relationship to biovars. Frontiers in Microbiology, 7, 2049. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.02049

World Health Organization, Food and Agriculture Organization of the United Nations, United Nations Environment Programme, World Organisation for Animal Health. (2022). One Health Joint Plan of Action (2022–2026).

World Health Organization. (2024). Laboratory Biosafety Manual (4th ed.). World Health Organization.